包裝規(guī)格：

產(chǎn)品簡介：

??超敏ECL發(fā)光底物是一種用于檢測免疫印跡膜上HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的目的條帶的高靈敏增強(qiáng)底物。這一獨(dú)特的發(fā)光底物系統(tǒng)是目前最靈敏的商業(yè)化熒光ECL檢測試劑，具有極高靈敏度和高信噪比。

??產(chǎn)品特色：

??發(fā)光迅速：通常1-5秒既出結(jié)果;

??極高靈敏度和高信噪比;

??使用方便：可在日光燈下進(jìn)行發(fā)光實(shí)驗(yàn)，(短時(shí)間暴露實(shí)驗(yàn)室常規(guī)照明不會損傷該試劑)。

使用方法：

??1. 將印記膜從蛋白轉(zhuǎn)印設(shè)備中取出,加入合適的封閉液在溫室下孵育20-60分鐘,同時(shí)振蕩;

??2. 將膜從封閉液中取出,與一抗工作液在溫室孵育1小時(shí),同時(shí)振蕩或在28℃孵育過夜,不振蕩;

??3. 用適當(dāng)?shù)木彌_液充分洗滌印跡膜。(將足量的洗滌緩沖液加至膜上,保證緩沖液將膜完全覆蓋,振蕩孵育>5分鐘,更換洗滌緩沖液并重復(fù)該步驟4-6次。增加洗滌緩沖液體積,洗滌次數(shù)和洗滌時(shí)間有助于降低背景信號);

??4. 用10-50 ng/mL二抗孵育印跡膜約30-60分鐘;

??5. 重復(fù)步驟3,以除去未結(jié)合的HRP標(biāo)記二抗(膜與HRP標(biāo)記二抗孵育后必須進(jìn)行徹底洗滌);

??6. 通過混合等份的本產(chǎn)品溶液A和本產(chǎn)品溶液B來制備發(fā)光工作溶液。每平方厘米印記膜使用0.1 mL發(fā)光工作溶液。已配制的工作溶液在室溫下可穩(wěn)定保存8小時(shí)。(注:暴漏于日光或任何其他強(qiáng)光下可能損害工作液,為獲得最佳結(jié)果,將此工作液保存在琥珀色瓶中,并避免長期暴漏于任何強(qiáng)光,實(shí)驗(yàn)室的常見照明不會損害工作液的穩(wěn)定性);

??7. 將印跡膜置于新配置的工作溶液中孵育5分鐘;

??8. 去除多余的工作溶液;

??9. 將印跡膜放在透明的塑料包裝或薄片保護(hù)膜中,去除氣泡 10將印跡暴露于X射線膠片或成像系統(tǒng)。

??抗體稀釋參考

??為獲得最佳顯色效果,必須優(yōu)化該系統(tǒng)的全部組分,包括樣品量、一抗和二抗?jié)舛纫约澳ず头忾]試劑的類型。??注意事項(xiàng)

??1.使用該產(chǎn)品比使用沉淀比色HRP底物檢測所需的抗體濃度低。為優(yōu)化抗體濃度,請進(jìn)行一次系統(tǒng)的點(diǎn)印跡分析;

??2. 工作液在室溫下8小時(shí)內(nèi)可以保持穩(wěn)定,但是應(yīng)該避免暴露在陽光下或任何其他強(qiáng)光環(huán)境,然而短期實(shí)驗(yàn)室照明強(qiáng)度不會破壞工作液的穩(wěn)定性;

??3. 封閉試劑有可能與抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng),導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性信號。封閉緩沖液同時(shí)也會影響系統(tǒng)的靈敏性,當(dāng)從一種底物轉(zhuǎn)換為另一種底物時(shí),有時(shí)會出現(xiàn)信號衰減或背景增加的現(xiàn)象,原因可能是封閉緩沖液不適合新的檢測系統(tǒng);

??4. 使用親和素/生物素檢測系統(tǒng)時(shí),避免使用牛奶作為封閉試劑,因?yàn)榕Ｄ讨泻胁欢康膬?nèi)源性生物素,會導(dǎo)致高背景信號;

??5. 保證洗滌緩沖液、封閉緩沖液、抗體溶液和底物工作液的使用體積,以確保在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中印跡膜完全被液體覆蓋,避免膜變干。增大封閉緩沖液及洗滌緩沖液的使用量可以降低非特異性的信號;

??6. 為獲得最佳效果,在孵育步驟請使用搖床;

??7. 將Tween20(終濃度0.05-0.1%)加入封閉緩沖液和稀釋的抗體溶液,以降低非特異信號;

??8. 不要使用疊氮鈉作為緩沖液的防腐劑,疊氨鈉是HRP的抑制物;

??9. 避免手與膜直接接觸,實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)戴手套或使用干凈的鑷子;

??10. 所有設(shè)備必須清潔且不沾染外來物質(zhì),金屬器械(如剪刀)不得具有可見的銹跡,銹跡可能導(dǎo)致斑點(diǎn)形成和高背景。

??圖像獲取

??1. 將包在塑料紙(膜)中的印跡膜置于膠片暗盒中，蛋白質(zhì)面朝上，除適用于膠片曝光的燈(如紅色安全燈)之外，關(guān)閉所有燈;

??注: 膠片必須在曝光期間保持干燥,為獲得最佳效果,采取以下措施:

??確保將多余的底物溶液從膜和塑料紙上完全去除;

??在整個(gè)膠片處理期間,使用手套;

??切莫將印記膜置于已顯影的膠片上,因?yàn)槟z片上的化學(xué)物質(zhì)會減弱信號。

??2. 將X光膠片置于膜的上面。建議第一次曝光60秒。之后可調(diào)整曝光時(shí)間以達(dá)到最佳結(jié)果。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在底物孵育后的前5-30分鐘期間是最強(qiáng)烈的,這一反應(yīng)可以持續(xù)幾個(gè)小時(shí),但強(qiáng)度會隨時(shí)間下降,如有底物孵育后較長時(shí)間后曝光,曝光時(shí)間可能需要延長以獲得較強(qiáng)信號。如果使用磷光存儲成像設(shè)備(如Bio-Rad的分子成像儀系統(tǒng))或CCD照相機(jī)可能需要較長的曝光時(shí)間;

??3. 使用合適的顯影劑和定影劑對膠片進(jìn)行顯影。如果信號太強(qiáng),則縮短曝光時(shí)間或?qū)⒂∮浤みM(jìn)行剝離并降低抗體濃度重新檢測。

??其他材料準(zhǔn)備

??已完成轉(zhuǎn)印的印跡膜:使用任何合適的電泳法分離蛋白質(zhì),并將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,也可使用其他類型的膜,但操作步驟可能需要進(jìn)行優(yōu)化;

??用于處理放射顯影膠片的膠片暗盒、顯影和定影試劑

??用于孵育的旋轉(zhuǎn)搖床;

??稀釋緩沖液:使用Tris或磷酸鹽緩沖液;

??洗滌緩沖液:將5mL 10%的Tween-20加入1000 mL稀釋緩沖液(Tween-20的終濃度將為0.05%);

??封閉試劑:將0.5mL10%的Tween-20加入100 mL的封閉緩沖液,選擇一種與稀釋緩沖液具有相同基本組分的封閉緩沖液;

??一抗:選擇一種目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性抗體,使用稀釋緩沖液制備該抗體的1 mg/ml儲液。使用封閉試劑將抗體從儲液稀釋成抗體工作液。稀釋度介于1:1,000和1:5,000之間或抗體工作液濃度為0.2-1 ug/mL。最佳稀釋度取決于一抗和膜上的抗原量;

??HRP標(biāo)記的二抗:選擇一種與二抗特異性結(jié)合的HRP標(biāo)記二抗,使用稀釋緩沖液制備該抗體的1 mg/ml儲備液。使用封閉試劑將抗體從儲備液稀釋成抗體工作液。稀釋度介于 1:20,000和1:100,000之間或抗體工作液濃度為10-50ug/ml,該濃度范圍在使用鏈親和素 HRP時(shí)也適用。二抗的最佳稀釋度取決于HRP標(biāo)記二抗和膜上的抗原量

??常見問題